Гіндулліна Т. М

Введення у флуоресценцію

Люмінесценція- випромінювання фотонів з електронно-збуджених станів - ділиться на два типи залежно від природи основного та збудженого станів , У синглетному збудженому стані електрон на енергетично вищій орбіталі і другий електрон на орбіталі з нижчою енергією мають протилежну орієнтацію спинів. Кажуть, що ці електрони спарені*. У триплетном стані ці електрони не спарені, тобто. їхні спини мають однакову орієнтацію. При поверненні електрона із збудженого синглетного стану в основне орієнтація його спина не повинна змінюватися. Зміна орієнтації спина необхідна при переході з триплетного стану в основний синглетний стан. Флуоресценція- це випромінювання, що відбувається при поверненні спареного електрона на нижчу орбіталь. Такі переходи квантовомеханічно "дозволені", а типові величини швидкостей випромінювання для них ~10 8 з -1. Високі значення швидкостей випромінювання призводять до часів згасання флуоресценції ~ 10 -8 с (10 нс). Час життя - це середній період часу, протягом якого флуорофор перебуває у збудженому стані. Фосфоресценція- це випромінювання, що відбувається при переході між станами різної мультиплетності **, як правило, зі збудженого триплетного стану до основного синглетного. Такі переходи не дозволені, і константи швидкості випромінювання малі. Типовий діапазон часу загасання фосфоресценції – від мілісекунд до секунд, що головним чином залежить від внеску інших процесів дезактивації. У цій книзі всюди ми насамперед розглядатимемо швидший процес флуоресценції.

У речовинах, що виявляють значну флуоресценцію, електрони переважно делокализованы і формально розташовані на сполучених подвійних зв'язках.

* Правильніше було б сказати, що спини цих електронів спарено. Спареними зазвичай називають електрони, що знаходяться на одній і тій же орбіталі, - Прим. ред.

** Мультиплетність стану називають величину т = 2s + 1, де s - сумарний електронний спин даного стану. Так, для синглетних станів т = 1 і s = 0, для триплетних - т = 3 та s = 1 - Прим.ред.

МАЛ. 1.1. Структури типових флуоресціюючих сполук.

МАЛ. 1.2. Спектри поглинання та випромінювання флуоресценції перилену та хініну (за даними).

Спектри випромінювання не можуть бути правильно зображені одночасно в шкалі довжин хвиль та в шкалі хвильових чисел. У цьому випадку використано правильне зображення у шкалі хвильових чисел. Довжини хвиль наведені для зручності (див. гл. 2).

Єдиним помітним винятком є ​​група елементів, які зазвичай називають лантаноїдами [1]. Флуоресценція іонів європію та тербію викликана переходами електронів між f-орбіталями, які екрановані від розчинника вищими заповненими орбіталями.

Флуоресцентні спектральні дані зазвичай представляють у вигляді спектрів випромінювання. Спектр випромінювання флуоресценції- це залежність інтенсивності флуоресценції від довжин хвиль (нанометрах) чи хвильових чисел (см -1). Два типових спектри випромінювання флуоресценції наведено на рис 1.2. Спектри випромінювання сильно змінюються і залежать як від хімічної структури флуорофору, так і від розчинника, в якому розчинений флуорофор. Спектри деяких сполук, таких як перилен, мають чітку структуру, обумовлену окремими коливальними рівнями енергії основного та збудженого станів. Інші сполуки, такі як хінін, мають спектри без коливальної структури.

*Коливальна структура спектрів випромінювання визначається коливальними підрівнями основного, а не збудженого електронного стану (докладніше см„ нижче). - Прим.. peд,

Поглинання і випромінювання світла добре ілюструє діаграма рівнів енергії, запропонована Яблонським [3], Основний, перший і другий електронні стани позначають S 0 , S, і S 2 відповідно (рис. 1.3). рівнів, що позначаються 0, 1, 2 і т. д. Вплив розчинника до уваги не приймається, воно буде розглянуто докладніше в гол. 7. Переходи між різними електронними рівнями позначені вертикальними лініями. Така вистава використовується, щоб наочно показати миттєву природу поглинання світла. Цей процес відбувається приблизно за 10 -15 с, час занадто короткий для помітного зміщення ядер (принцип Франка - Кондона).

Енергетична щілина між різними коливальними рівнями енергії видно зі спектру випромінювання перилену (див. рис. 1.2). Окремі максимуми випромінювання (а отже, і коливальні рівні енергії) відстоять один від одного приблизно на 1500 см-1. Відносне число молекул перилену, що знаходяться в коливальних станах 0 і 1, описується розподілом Больцмана:

Відношення R числа молекул у двох станах з різницею енергій Е дається виразом

R = e -  E/kT (1.1)

де k – константа Больцмана; Т - абсолютна температура, К. При кімнатній температурі 300 До відношення R дорівнює 0,01. Отже, більшість молекул перебуватиме в нижньому коливальному стані; саме такі молекули і поглинають світло.

МАЛ. 1.3. Діаграма Яблонської.

За поглинанням світла зазвичай слідує кілька інших процесів. Порушення флуорофора, зазвичай, відбувається до деякого вищого коливального рівня станів (S 1 чи S 2). 3а деякими рідкісними винятками, для молекул у конденсованій фазі характерна швидка релаксація на нижній коливальний рівень стану S 1 . Цей процес називається внутрішньою конверсієюі відбувається здебільшого за 10 -12 с. Оскільки типові часи згасання флуоресценціїблизькі до 10 -8, внутрішня конверсія зазвичай повністю закінчується до процесу випромінювання. Отже, випромінювання флуоресценції найчастіше здійснюється з термічно рівноважного збудженого стану. Аналогічно поглинання зворотний перехід електронів на нижній електронний рівень також призводить до коливально збудженого стану (рис. 1.3). Термічне рівновагу досягається за час 10 -12 с. Цікавим наслідком такого розгляду є те, що спектр поглинання молекули відображає коливальну структуру збуджених електронних станів, а спектр випромінювання - коливальну структуру основного електронного стану. У більшості випадків електронне збудження не сильно змінює розташування коливальних рівнів енергії. Внаслідок цього коливальні структури, які у спектрах поглинання і випромінювання, подібні.

Молекули в стані S 1 можуть також піддаватися конверсії в перший триплетний стан Т 1. Випускання з Т 1 зване фосфоресценцією, зазвичай зрушене у бік більших довжин хвиль (менших енергій) порівняно з флуоресценцією. Конверсія S 1 в Т 1 називається інтеркомбінаційною конверсією. Перехід з Т 1 в основний стан заборонений, внаслідок чого константа швидкості такого випромінювання на кілька порядків менша за відповідну константу для флуоресценції. На випуск флуоресценції можуть впливати й інші фактори, не показані в явному вигляді на рис. 1.3: вплив розчинників, релаксація розчинника, гасіння, і навіть реакції, які у збуджених станах. Всі вони будуть детально розглянуті в наступних розділах книги.
1.2 Характеристики випромінювання флуоресценції

Для явища флуоресценції відомо кілька основних показників. Існують і винятки, але вони рідкісні. Якщо якась із нижче перерахованих характеристик відсутня у даного флуорофору, можна зробити висновок про деякі особливі властивості цієї сполуки,

1.2.1. Стокс зрушення

Зазвичай, завжди спостерігається зсув випромінювання щодо поглинання у бік великих довжин хвиль, тобто. втрата енергії (виключення – атоми в газовій фазі). Це вперше спостерігав Стоке в 1852 р. в Кембриджі [4], використовуючи при цьому апаратуру, принцип дії якої зображений на рис. 1.4. Джерелом ультрафіолетового збудження служило сонячне світло, пропущене через платівку з блакитного скла. Перед приймачем як жовтий фільтр стояв склянку з вином, Флуоресценція хініну лежить в області 450 нм і тому добре помітна неозброєним оком. Нині визначення величини стоксова зсуву використовують інші методи.

Втрати енергії між збудженням та випромінюванням незмінно спостерігаються для флуоресціюючих молекул у розчинах. Однією з основних причин виникнення зсуву стоксу є швидка релаксація на нижній коливальний рівень стану S 1 . До того ж зазвичай відбувається перехід на збуджені коливальні рівні стану S0 (див. рис. 1.3), що призводить до додаткової втрати коливальної енергії.

МАЛ. 1.4. Схема першої установки виявлення стоксового зсуву.

Спектр випромінювання флуоресценції зазвичай залежить від довжини хвилі збудження. При збудженні на вищі електронні та коливальні рівні надлишок енергії швидко витрачається, переводячи флуорофор на нижній коливальний стан.S 1 . Ця релаксація відбувається за час порядку 10 -12 с і є, мабуть, результатом сильного перекриття безлічі станів з приблизно рівними енергіями. Завдяки такій швидкій релаксації довжина хвилі збудження зазвичай не впливає на спектр випромінювання. Існують винятки (наприклад азулен), коли випромінювання може відбуватися як з S 2 -, так і з S 1 -стану. Крім того, збудження на червоному краї спектра поглинання часто веде до зсуву флуоресценції в довгохвильову область. Цей зсув обумовлений тим, що збудження на червоному краю спектру вибірково можливе для тих флуорофорів, які найбільше взаємодіють з розчинником.

Зазвичай спектр випромінювання флуоресценції є дзеркальним відображенням спектра поглинання, точніше, того поглинання, яке відповідає переходу з S 0 в S 1. Це особливо наочно у випадку перилену (див. рис. 1.2). Симетрична природа цих спектрів визначається тим, що і поглинання, і випромінювання обумовлені тими самими переходами, а також подібністю коливальних енергетичних рівнів станів S0 і S1. Для багатьох молекул різний розподіл електронів у станах S0 та S1 істотно не впливає на ці рівні енергії. Згідно з принципом Франка – Кондона, всі електронні переходи відбуваються без зміни міжядерної відстані. В результаті, якщо дана ймовірність переходу (фактор Франка - Кондона) між нульовим і другим коливальними рівнями максимальна при поглинанні, відповідний перехід буде найімовірнішим також у випусканні (рис. 1.5).

МАЛ. 1.5. Правило дзеркальної симетрії та фактори Франка – Кондона.

Необхідною умовою для дзеркальної симетрії є представлення спектрів поглинання та випромінювання у відповідних одиницях. Найкраща симетрія повинна існувати між модифікованими спектрами (v)/v та F(v)/v 3 , де  (v) - коефіцієнт поглинання, що відповідає хвильовому числу v, a F(v) - відносний потік фотонів в інтервалі хвильових чисел Δ v [5]. Відповідність між такими спектрами зазвичай спостерігається для ароматичних поліядерних вуглеводнів.

Незважаючи на те, що правило дзеркальної симетрії часто виконується, з нього існує багато винятків. Як приклад на рис. 1.6 наведено спектри флуоресценції дифенілу. У спектрі випромінювання видно коливальну структуру, яка відсутня в спектрі поглинання. Таке відхилення від правило дзеркальної симетрії зазвичай свідчить про різне геометричне розташування ядер переважно і збудженому станах.

МАЛ. 1.6. Спектри поглинання та випромінювання дифенілу.

Крім геометричних перегрупувань відхилення від правила дзеркальної симетрії можуть викликати реакції в збуджених станах. Так, наприклад, для фенолу та тирозину спостерігається по дві смуги випромінювання, причому довгохвильове випромінювання більш помітно при високих концентраціях акцепторів протона (див, рис, 11,18). Величина рК а фенольної гідроксильної групи зменшується від 11 в основному до 4 стані в збудженому стані.

МАЛ. 1.7. Спектри випромінювання пірена та його ексимера (за даними).

Відносна інтенсивність максимуму флуоресценції ексимера (470 нм) зменшується при зниженні концентрації пірена від 6x10 - 3 М (верхня крива) до 0,9x10 -1 М (нижня крива).
Слідом за збудженням фенольний протон переходить до акцепторів протону в розчині. Залежно від концентрації цих акцепторів у спектрі випромінювання може переважати флуоресценція або фенолу, або феноляту. Примітно те, що навіть незважаючи на відсутність активних груп, багато поліядерних ароматичних вуглеводнів також вступають в реакції в збуджених станах. Так, наприклад, молекули пірена в збудженому стані об'єднуються в комплекси, які називаються ексімерами (скорочення від excited dimers - збуджені димери). Випускання ексимерів змішане в довгохвильову область порівняно з випромінюванням мономерів пірена, в ньому відсутня коливальна структура (рис.1.7). Комплекси, що утворюються у збудженому стані, називають ексіплекс.
1.3. Часи згасання та квантові виходи флуоресценції

Часто вимірюють часи згасання та квантові виходи флуоресціюючих сполук. Сенс цих параметрів добре видно із модифікованої діаграми Яблонського (рис. 1.8). На цій діаграмі ми детально не вказуємо окремі процеси релаксації, що призводять до релаксованого стану S 1 , а звертаємо велику увагу на процеси, які відповідальні за повернення в основний стан. Зокрема, нас цікавить константа швидкості випромінювальної дезактивації флуорофору (Г) та константа швидкості безвипромінювальної дезактивації у стан S 0 (k).

Квантовий вихід флуоресценції- це відношення числа випущених фотонів до поглинених. Обидві константи швидкості Г та k відповідають процесам зменшення заселеності збудженого стану. Частка молекул флуорофору, які дезактивуються з випромінюванням, а отже, і квантовий вихід визначаються виразом

Q = Р/(Р+k) (1.2)

Квантовий вихід близький до одиниці в тому випадку, якщо константа швидкості безвипромінювальної дезактивації набагато менша за константу швидкості випромінювання, тобто k « Г. Зауважимо, що енергетичний вихід флуоресценції завжди менше одиниці через стоксові втрати. Для зручності ми згрупували всі можливі процеси безвипромінної дезактивації одну константу швидкості k.

МАЛ. 1.8. Модифікована діаграма Яблонської.

Час життя збудженого стану визначається як середній час, протягом якого молекула перебувала у збудженому стані до того, як повернутися до основного стану. Зазвичай час згасання флуоресценції -10 нс, Для флуорофора, що описується діаграмою Яблонського (рис. 1.8), час згасання дорівнює

τ = 1/(Г+k) (1.3)

τ 0 = 1/Г (1.4)

Q = τ / τ 0 (1.5)

Квантовий вихід та час життя можуть змінюватися під дією будь-яких факторів, що впливають на константи швидкості. Наприклад, молекула може виявитися нездатною флуоресцировать через велику швидкість внутрішньої конверсії чи мінімальної швидкості випромінювання. Сцинтилятори зазвичай вибирають за їхні високі квантові виходи, які є результатом великих значень Г. Їм зазвичай відповідають короткі часи життя, близько 1 нс. Флуоресценція ароматичних сполук, що містять групи N0 2 зазвичай слабка, в першу чергу через велику величину k. Перехід триплет-синглет заборонений по симетрії, і константи швидкості спонтанного випромінювання становлять ~10 3 с-1 або менше **. Оскільки значення k близькі до 10 9 с-1 квантові виходи фосфоресценції малі при кімнатній температурі. З рівняння (1.2) можна отримати квантові виходи фосфоресценції, що дорівнює 10 -6 .

* Правильніше називати його радіаційним (випромінювальним) часом життя. - Прим. ред.

** Автор наводить надто велике значення k для внутрішньомолекулярної безвипромінювальної дезактивації триплетних станів, яка зустрічається рідко – лише для молекул, що зазнають хімічних перетворень (зокрема, ізомеризації). Через спинову заборону безвипромінювальний інтеркомбінаційний перехід Т 1 → S 0 для більшості молекул має константи швидкості k 1.4. Анізотропія флуоресценції

Флуорофори переважно поглинають ті фотони, електричні вектори яких спрямовані паралельно моменту переходу флуорофору. Момент переходу має певну орієнтацію у молекулі флуорофора. В ізотропних розчинах молекули флуорофорів орієнтовані випадковим чином. При збудженні поляризованим світлом селективно збуджуються ті молекули флуорофору, для яких дипольний момент переходу при поглинанні паралельний електричному вектору збуджуючого світла (див. Розд. 5.2.1). Таке селективне збудження частково орієнтованого набору флуорофорів (фотоселекція) призводить до частково поляризованого випромінювання флуоресценції. Для кожного флуорофора моменти переходу для поглинання та випромінювання мають фіксовану орієнтацію, і кут між ними визначає максимальну вимірювану анізотропію r 0 див. рівняння (5.20)]. Анізотропія (r) та поляризація (Р) флуоресценції виражаються рівняннями

(1.6), (1.7)

де I || і I ┴ інтенсивності флуоресценції вертикально (II) та горизонтально (┴) поляризованого випромінювання у разі порушення зразка вертикально поляризованим світлом. Анізотропія і поляризація - це вирази того самого явища, тому їх можна взаємозамінювати, використовуючи рівняння (5.3) і (5.4). Деякі фактори можуть зменшувати вимірювану величину анізотропії до значень нижче максимального. Найпоширеніший з них - обертальна дифузія, яка відбувається за час життя збудженого стану і зміщує флуорофора, що випускає диполь. Вимірювання цього параметра дає інформацію про відносне кутове змішування флуорофора в інтервалі між поглинанням та випромінюванням. Перенесення енергії збудження між флуорофорами також призводить до зменшення анізотропії.

Припустимо, що єдиним суттєвим процесом, що призводить до зменшення анізотропії, є обертальна дифузія. Тоді вимірювана анізотропія визначиться виразом

,

де r 0 - анізотропія, яка повинна була б вимірюватися за відсутності обертальної дифузії, а φ - час кореляції для процесу дифузії, що визначається як

φ = ηV/kТ (1.9)

де η - в'язкість розчину; k – константа Больцмана; Т – абсолютна температура; V -об'єм фрагмента, що обертається. Розглянемо білок з молекулярною масою 50 000. Оскільки питомий об'єм білків становить 0,73 мл/г, можна легко підрахувати, що при 25° С у водному розчині (n = 0,00894 П) очікуваний час кореляції становить 13 нc для безводної сфери. Оскільки білки гідраговані, фактичний час кореляції, мабуть, має бути більшим. Однак суттєвим є те, що часи обертальної кореляції для більшості білків можна порівняти з типовими часами загасання флуоресценції. Тому результати вимірювання анізотропії флуоресценції залежать від усіх факторів, що впливають швидкість обертальної дифузії. Тому вимірювання поляризації флуоресценції широко використовують для вивчення гідродинамічних властивостей макромолекул.

1.5. Тимчасова шкала молекулярних процесів у розчині

Флуоресцентна спектроскопія – ефективний метод дослідження динамічних процесів у розчинах, що становлять інтерес для біологів. Така можливість пов'язана насамперед із часом життя збуджених станів. Внаслідок принципу Франка – Кондона абсорбційна спектроскопія може дати інформацію лише про усереднені характеристики основного стану молекул, що поглинули світло. Оскільки тільки ті мо-ієкули розчинника, які безпосередньо сусідять з поглинаючими частинками, впливатимуть на їх спектр поглинання, абсорбційна спектроскопія може дати інформацію лише про деяку середню сольватну оболонку розчинника, що сусідить з хромофором, і не відображає молекулярну динаміку.

На противагу цьому параметри флуоресцентної спектроскопії є чутливими функціями всіх процесів, що протікають за час збудженого стану, причому в цих процесах можуть брати участь молекули, що знаходяться в момент збудження на відстанях до 100 А від флуорофору. Хоча може здатися, що 10 нс - надто короткий проміжок часу, фактично це великий час у порівнянні з часом руху малих молекул у рідкому розчині. Обертальна дифузія пов'язаних з білками і мембранами флуорофорів також укладається в цей часовий діапазон.

Гасіння флуоресценції молекулярним киснем за механізмом зіткнень є показовим прикладом розмірів просторового та тимчасового діапазонів, що представляються часом затихання флуоресценції. Якщо флуорофор, що у збудженому стані, стикається з молекулою кисню, він повертається у основний стан без випромінювання фотона. Коефіцієнт дифузії кисню у воді при 25 ° С дорівнює 25 10 -3 см 2 /с. Середня відстань [(Δх 2) 1/2], на яку може дифундувати молекула кисню за 10 -3 с, визначається рівнянням Ейнштейна:

Δ x 2 = 2Dτ (1.10)

Відстань [(Δх 2) 1/2] становить ~ 70 Å, що порівняно з товщиною біологічної мембрани або діаметром білка. Для деяких флуорофорів часи життя досягають 400 нc, тому можна спостерігати дифузію молекул кисню на відстані понад 450 А. Навпаки, вимірювання поглинання дають відомості лише про безпосереднє оточення флуорофору і, отже, про миттєве середнє оточення.

Вплив молекулярної динаміки на спектри флуоресценції також виявляється під час розгляду енергій. Органічні молекули, як правило, поглинають світло в діапазоні довжин хвиль 200-500 нм, що відповідає енергіям від 140 до 60 ккал/моль. Після поглинанням у флуорофора змінюється (зазвичай зростає) дипольний момент. Якщо молекули розчинника також мають дипольні моменти, вони переорієнтуються навколо диполя збудженого стану, знижуючи цим його енергію. Цей процес називається релаксацією розчинника та відбувається у рідких розчинах за 10 -12 с. Релаксація розчинника може призводити до значних зсувів стоксів. У білках триптофанові залишки поглинають світло з довжиною хвилі 280 нм, а флуоресценцію випускають при -350 нм. Таким чином, за кілька наносекунд, що проходять до процесу випромінювання, витрачається 20 ккал/моль.

В основі будь-якого експерименту лежать вимір деякої величини та кореляція отриманих результатів з явищем, що становить інтерес для дослідника. Тимчасовий діапазон між поглинанням світла і подальшим його випромінюванням достатній для протікання декількох процесів, кожен з яких призводить до ослаблення спектральних спектральних характеристик флуоресценції. До таких процесів відносяться зіткнення з гасниками, обертальна та поступальна дифузія, утворення комплексів з розчинниками або з розчиненими речовинами та переорієнтація оточення молекули у збудженому стані із зміненим дипольним моментом. Ці динамічні процеси можуть впливати на анізотропію флуоресценції, квантові виходи, часи життя та спектри випромінювання. В результаті спектральні характеристики флуорофорів можуть дати велику інформацію про динамічні процеси, що протікають за час випромінювання флуоресценції.

1.6. Флуорофори

1.6.1 Природні флуорофори

З великої кількості молекул біологічних речовин багато хто є природними, або природними, флуорофорами. Ми коротко підсумовуємо інформацію про широко відомі флуорофори, що дає основу для наступних розділів. Такий конспективний виклад не є вичерпним.

БІЛКИ Триптафан - найбільш інтенсивно флуоресцентна амінокислота в білках. Близько 90% усієї флуоресценції білків зазвичай зумовлено триптофановими залишками. "Цей природний флуорофор вкрай чутливий до полярності навколишнього середовища. Спектральні зрушення часто є наслідком кількох явищ, серед яких можна виділити зв'язування лігандів, асоціацію білок - білок і денатурацію. Крім того, максимуми випромінювання білків відображають середню доступність їх триптофанових залишків. поглинають світло близько 280 нм, а максимуми спектрів флуоресценції лежать в області 320 -350 нм.

Тирозин інтенсивно флуоресціює в розчині, проте в білках його флуоресценція значно слабша. Денатурація білків зазвичай посилює випромінювання тирозину. Як і для фенолу, рак тирозину дуже сильно зменшується при збудженні, і може відбуватися іонізація в збудженому стані.

Нуклеїнові кислоти Нуклеотиди та нуклеїнові кислоти зазвичай не флуоресціюють. Проте є деякі винятки. tRNA Phe із дріжджів містить інтенсивно флуоресцентну основу, відому як Y-основу, яка має максимум випромінювання поблизу 470 нм, а час життя ~6 нc.

Кофактори NADH флуоресціює сильно, і максимуми його поглинання та випромінювання знаходяться при 340 і 450 нм відповідно. NAD + не флуоресціює. Час загасання флуоресценції NADH у водному буфері становить приблизно 0,4 нс. Флуоресцентною групою є відновлене нікотинамідне кільце, причому його флуоресценція частково загашена за рахунок зіткнень із залишком аденіну. При зв'язуванні NADH з білками квантовий вихід флуоресценції збільшується зазвичай у чотири рази. Таке збільшення виходу зазвичай інтерпретують як наслідок зв'язування NADH у витягнутій конформації, що підтверджується вивченням дифракції рентгенівських променів гідрогеназах.

РИБОФЛАВІН І FAD. Рибофлавін, FMN (флавінмононуклеотид) і FAD (флавінаденіндинуклеотид) поглинають світло у видимій області (-450 нм) і випускають в області 515 нм. Типові часи життя для FMN та FAD становлять 4,7 та 2,3 нс відповідно. Як і для NADH, флуоресценція флавіна динамічно гаситься аденіном. Далі, FAD також утворює комплекс-симссоциати , в яких флуоресценція флавна потушена аденіном (статичне гасіння). Флагопротеїни в основному не флуоресціюють, проте знову ж таки існують винятки.

1.6.2. Штучні фпуорофори

Часто природні флуоресцентні властивості макромолекул неможливо отримати з експерименту бажану інформацію. Так, наприклад, флуоресценція білка і навіть поляризація цієї флуоресценції не відображають явище, яке хочуть охарактеризувати кількісно.

ІЗОЦІАНАТИ ТА ІЗОЦІОЦІАНАТИ ФЛУОРЕСЦЕЇНУ ТА РОДАМІНУ. Ці барвники широко використовують як мітки для білків. Мічені флуоресцеїном імуноглобуліни – комерційні реактиви; їх часто використовують у флуоресцентній мікроскопії. Саме ці речовини вибирають через високі квантові виходи та стійкість до фото знебарвлення. Крім того, завдяки великим довжинам хвиль поглинання та випромінювання (рис. 1,9) зведена до мінімуму проблема фонової флуоресценції біологічних зразків і можна уникнути застосування кварцової оптики. Ізоціанатна або ізотіоціанатна групи знаходяться або в мета-, або в параположенні до карбокси-групи (див. рис, l.l). Комерційні мічені реагенти є сумішшю ізомерів. Ці барвники реагують насамперед із лізиновим чи цистеїновим ділянкою білків. Часи загасання флуоресценції барвників близько 4 нс, які спектри випромінювання мало чутливі до полярності розчинника. Ці барвники дуже підходять для кількісного визначення ступеня асоціації невеликих мічених молекул із білками на підставі зміни поляризації флуоресценції.

Дансілхлорид. Дансилхлорид (DNS-C1) широко використовують як мітку для білків (рис. 1.10), особливо в тих випадках, коли проводять вимірювання поляризації. Ця речовина давно відома [8] і має зручне вре-ся життя флуоресценції (~ 10 нс). На спектр випромінювання дансильної групи сильно впливає полярність розчинника.

МАЛ. 1.9. Спектри збудження та випромінювання бичачого γ-глобуліну. міченого зотіоціанатом флуоресцеїну (за даними [7]).

МАЛ. 1.10. Штучні флуорофори, що часто використовуються.

Гідрофобні мембранні зонди. Ліпіди зазвичай не флуоресціюють. Мембрани часто мітять такими зондами, як перилен, 9-вінілантраЦен та 1,6-дифенілгексатрієн (DРН) (рис. 1.10). Ці зонди нерозчинні у воді та вбудовуються у гідрофобні ділянки мембран. Незаміщені багатоядерні ароматичні вуглеводні та DPH малочутливі до полярності розчинника. Їх використовують у першу чергу для оцінки внутрішньої в'язкості подвійних шарів за вимірами поляризації їхньої флуоресценції (розд. 5.7.1). Шляхом цілеспрямованої зміни хімічної будови зонди можуть бути локалізовані на вибраних ділянках мембрани. Одним із таких прикладів є триметиламонієва сіль DPH (ТМA-DPH). Вважають, що заряджений атом азоту призводить до локалізації ТМА-DPH в області ліпідно-водної межі мембран [14].

Інші зонди, як, наприклад, PATMAN (рис. 1.11), дуже чутливі до фазового стану ліпідних бислоев [9]. При температурі перебудови мембран спектр випромінювання РАТМАН спалюється на 40 нм у довгохвильову область: від 425 до 465 нм. Очевидно, цей зонд реагує на релаксацію мембрани навколо диполі збудженого стану флуорофора (розд. 8.6). Було запропоновано й інші зонди. Чутливість до потенціалу мембрани може бути пов'язана зі зміною орієнтації зонда або його локальної концентрації в мембрані, а також з впливом електричного поля електронний розподіл в зонді [11]. І нарешті, можна виділити зонди, які зазнають реакцій у збудженому стані. У збудженому стані зонд Р 2 -З 3 може утворювати внутрішньомолекулярний ексімер, і частка ексімерів, що утворилися, визначає в'язкість в їх найближчому оточенні.

Нуклеїнові кислоти. При введенні етиленового містка флуоресценція АТР та його похідних стає інтенсивнішою [12]. Такі похідні ε-АТР (рис. 1.11) чутливі до в'язкості розчинника мають високу граничну поляризацію флуоресценції, і часи загасання їх флуоресценції близькі до 23 нс. Нуклеотидні аналоги активні у багатьох реакціях, що каталізуються ферментами. Крім того, були синтезовані такі аналоги нуклеотидів з витягнутою конформацією, як лін-бен-зо-АМР.

Підсумовуючи, можна сказати, що флуоресценцією мають різноманітні молекули і спектральні властивості флуорофорів впливає низку чинників і процесів. Як наслідок цього, флуоресцентні методи корисні вивчення властивостей розчинів і біологічних макромолекул.

МАЛ. 1.11. Штучні флуорофори, що часто використовуються.

Люмінесценція виникає після поглинання світла і є випромінювальний перехід з електронно-збуджених станів в основний стан. Залежно від природи основного та збудженого станів люмінесценцію можна розділити на два типи. Як відомо, спини електронів, один з яких знаходиться в основному в синглетному стані, а другий у збудженому синглетному стані мають протилежну орієнтацію (спини електронів спарені). Перехід електрона із збудженого синглетного стану в основний синглетний стан квантовомеханічно дозволений, оскільки в цьому випадку зміна орієнтації спина не повинна відбуватися. Інша ситуація спостерігається для триплетного стану, в якому спин електрона має тугішу орієнтацію, що і спин електрона в основному синглетному стані. Тому при переході електрона з триплетного стану до основного синглетного стану необхідна зміна орієнтації спина електрона. А цей процес квантовомеханічно заборонено.

Очевидно, що для цих двох типів переходів електронів повинні суттєво відрізнятися величини швидкостей випромінювання. Дійсно, для квантовомеханічно дозволених синглет-синглетних переходів типові величини швидкостей випромінювання ~ 108 с-1, що відповідає часом загасання свічення ~ 10-8 с. Цей тип люмінесценції і отримав назву флуоресценція. Другий тип люмінесценції називається фосфоресценцією - і є випромінюванням, що відбувається при переході між станами різної мультиплетності, як правило з збудженого триплетного стану в синглетний стан. Оскільки дані переходи квантовомеханічно заборонені, типовий діапазон часу загасання фосфоресценції коливається від мікросекунд до секунд, що головним чином залежить від вкладу інших процесів дезактивації енергії електрона в збудженому стані. Таким чином, залежно від тривалості післясвітлення люмінесценцію можна поділити на флуоресценцію та фосфоресценцію.

Процеси поглинання та випромінювання світла безвідносно до зміни ядерних координат можна наочно продемонструвати за допомогою діаграми Яблонського (див. рис. 1).

Мал. 1. Діаграма Яблонського, що ілюструє енергетичні рівні
молекули та швидкості переходів. Прямі лінії - радіаційні переходи,
хвилясті - безвипромінювальні переходи

Основний синглетний стан, перший і другий збуджений синглетний стан позначимо S0, S1, S2 відповідно. Кожен із цих рівнів енергії може складатися з безлічі коливальних підрівнів, а ті у свою чергу складаються з безлічі обертальних підрівнів (не показані на рис. 1).

Відповідно до розподілу Больцмана, при кімнатній температурі більшість молекул знаходяться на нижньому коливальному рівні основного синглетного стану S0. Саме такі молекули переважно і будуть поглинуті.
ти випромінювання.

Отже, збудження зазвичай походить із основного синглетного стану S0 на різні коливальні рівні збуджених синглетних станів Sn (n = 1, 2, …). Переходи між різними підрівнями показані прямими лініями. Таке уявлення використовується у тому, щоб показати миттєву природу поглинання світла. Цей процес відбувається під час порядку періоду світлових коливань, тобто. приблизно 10-15 з. За цей час ядра не зазнають помітного усунення (принцип Франка - Кондона).

Далі для молекул у конденсованій фазі найбільш ймовірним процесом є їх перехід зі збуджених синглетних станів на нижній коливальний рівень збудженого стану S1 за рахунок швидких безвипромінювальних переходів (внутрішня конверсія) за час фемтосекунд. Оскільки типові часи загасання флуоресценції близькі до 10-8 с, то внутрішня конверсія зазвичай закінчується до моменту акту випромінювання. Тому, випромінювання флуоресценції найчастіше здійснюється з термічно рівноважного збудженого стану.

Зворотний випромінювальний перехід електронів (флуоресценція), аналогічно акту поглинання може відбуватися на різні коливальні рівні основного синглетного стану S0 зі швидкістю Kф. Після чого відбувається їхня безвипромінювальна дезактивація на основний коливальний рівень за часи порядку 10-12 с.

Молекули в стані S1 можуть бути піддані й іншим переходам. Наприклад, можливий безвипромінювний перехід (внутрішня конверсія) у стан S0 зі швидкістю Kвк, безвипромінювальна передача енергії сусіднім молекулам зі швидкістю Kпэ. Крім того, молекули в стані S1 можуть також піддаватися інтеркомбінаційної конверсії в перший триплетний стан Т1 зі швидкістю Kікк. Далі можливий випромінювальний перехід молекули з триплетного стану до основного синглетного (фосфоресценція). Однак, як було сказано раніше такий перехід квантовомеханічно заборонено, внаслідок чого константа швидкості для фосфоресценції на кілька порядків менша за відповідну константу для флуоресценції.

Сума всіх кінетичних швидкостей обернено пропорційна часу життя τ збудженого стану S1, тобто:

Ставлення є квантовий вихід флуоресценції. На випромінювання флуоресценції можуть впливати й інші фактори, наприклад, гасіння люмінесценції, вплив розчинника та ін.

Є. О. Пучков,
доктор біологічних наук, Інститут біохімії та фізіології мікроорганізмів ім. Г. К. Скрябіна РАН
«Хімія та життя» №9, 2014

Одразу дві статті цього номера «Хімії та життя» розповідають про світіння біооб'єктів. На фото зліва - малощетинковий черв'як Fridericia heliotaвідкритий вченими з Красноярського університету. Про те, як був досліджений його люциферин – речовина, яка при окисленні ферментом люциферазою випромінює блакитне світло, – читайте у статті «Вогники під ногами». На фото справа – синтетичний люциферин фридериції у присутності АТФ та інших необхідних компонентів демонструє таке ж свічення, як і екстракт білкового черв'яка. Це підтверджує, що структура люциферину встановлена ​​правильно.

На відміну від флуоресцентних мікроскопів, проточні цитометри не дають можливості помилуватися флуоресцентними об'єктами. Їхня сильна сторона - швидкість реєстрації сигналів від одиничних об'єктів, наприклад від клітин у суспензії. Звичайний комерційно доступний цитометр працює зі швидкістю 1000 клітин на секунду, а спеціалізовані високопродуктивні - до 25 000 клітин на секунду! У стандартному варіанті у кожного об'єкта вимірюються від двох до десяти параметрів: світлорозсіювання та флуоресценції одного або кількох флуорофорів. Таким чином можна отримати статистично достовірні результати гетерогенності клітинних, зокрема мікробних, популяцій. Існують також прилади, здатні сортувати клітини за певними параметрами світлорозсіювання або флуоресценції, щоб вивчати субпопуляції з використанням інших методів.

...І що з них можна дізнатися

Отже, всі флуоресцентні репортери мають спеціалізацію, тобто здатні вибірково характеризувати певні властивості біологічної системи. Зупинимося коротко на деяких категоріях «фахівців».

За допомогою низки флуоресцентних репортерів (як правило, органічних флуорофорів) можна стежити за ферментативним каталізом - дослідити динаміку ферментативних реакцій, їх локалізацію в клітинах, тканинах, органах тощо. Це, наприклад, субстрати з ковалентно приєднаними флуорофорами, які починають після вивільнення в ході реакції, або профлуорофори, що стають флуоресцентними при взаємодії з продуктом реакції.

Репортери, сформовані на основі антитіл - фізичні комплекси або ковалентні сполуки флуорофорів з антитілами - інформують про перебіг імунологічних реакцій. Флуоресціюючим компонентом може бути будь-який з відомих органічних і неорганічних флуорофорів, включаючи квантові точки. Крім того, до антитіл можна приєднувати ферменти, що каталізують реакції з утворенням флуоресцентного продукту. Сучасні технології дозволяють отримати антитіла до будь-якого білка (антигена), що цікавить дослідника, а антитіло з флуоресцентною міткою змусить світитися цей білок або структуру, з нього побудовану. Наприклад, за допомогою флуоресцентних антитіл виявлено мікрофібрили у фібробластах мишей (див. фото на другій сторінці обкладинки).

Дуже інформативними є методи з використанням флуоресцентних білків (ФБ). Ми вже згадували про те, наскільки корисні методи впровадження в клітину генів гібридних білків, які змушують флуоресціювати природний білок або навіть нуклеїнову кислоту. До того ж флуоресценція ФБ-гібридних білків, що містять, залежить від кислотності середовища, що дозволяє вимірювати рН не тільки всередині клітини, але і всередині окремих органел, якщо такий білок «адресований» в ядро ​​або мітохондрію.

Особливий інтерес викликає застосування ФБ у поєднанні з методиками вимірювання флуоресценції, що ґрунтуються на безвипромінювальній передачі енергії. Уявіть собі два гібридні білки, один з яких змушує флуоресціювати інший при зближенні. Подібним чином можна вивчати конформаційні (структурні) зміни в білках, якщо приєднати ФБ до різних ділянок однієї білкової молекули.

Чутливість флуоресценції до фізичних властивостей мікрооточення флуорофорів дозволяє використовувати деяких з них як репортери різних параметрів внутрішньоклітинного середовища. Серед них, наприклад, в'язкість цитоплазми, внутрішнього вмісту органел, гідрофобного шару біомембран. Взаємодія деяких флуорофорів із біологічними мембранами залежить від різниці електричних потенціалів на мембрані: за допомогою таких репортерів одержують відомості про величину мембранного потенціалу. Існують навіть репортери для вимірювання внутрішньоклітинної температури!

Не тільки на око

Можливості зорового аналізу обмежені переважно якісною оцінкою: «є світіння - немає світіння». Набагато більше інформації дають кількісні характеристики (див. розділ «Мова флуоресцентних репортерів»).

Для кількісної характеристики флуоресценції використовують дві методології. Перша служить для вимірювання різних характеристик флуоресценції в порівняно великій (макроскопічній) області об'єкта, що забезпечує отримання усереднених характеристик по об'єкту: розчину, суспензії колоїдних частинок, клітин, субклітинних частинок і т.п. та субклітинні частки.

Вимірювання інтегральної флуоресценції проводять за допомогою спектрофлуориметрів (флуоресцентних спектрофотометрів) та планшетних флуориметрів (англ. plate readers). Спектрофлуориметри-це, як правило, аналітичні прилади, на яких можна отримати всі основні характеристики флуоресценції. Планшетні флуориметри - пристрої для аналізу великої кількості зразків (іноді більше тисяч), але лише за декількома фіксованими характеристиками, наприклад за інтенсивністю флуоресценції у певній спектральній області та/або за часом життя флуорофорів у збудженому стані. Більшість методик з використанням планшетних флуориметрів ґрунтується на імунологічних реакціях або на аналізі розвитку культур клітин у моношарах.

Методологія вимірів флуоресценції одиничних мікроскопічних об'єктів також має два варіанти.

Перший ґрунтується на отриманні цифрових зображень об'єктів з подальшим комп'ютерним аналізом. Другий – на «поштучному» вимірі флуоресценції мікрооб'єктів у потоці, при проходженні через вузький капіляр спеціального приладу – проточного цитометра.

Флуоресцентна мікроскопія нещодавно пережила справжню революцію: розроблено нові пристрої, насамперед конфокальні мікроскопи, в яких збудження та реєстрація флуоресценції здійснюються через мікроскопічний отвір, що відсікає «зайве» свічення, яке виникає поза фокусом об'єктива. Ця "зіниця" сканує зображення в горизонтальній та/або вертикальній площині, сигнали реєструє фотопомножувач, і після їх комп'ютерної обробки виходить просторове зображення об'єкта. Така конструкція дозволяє отримувати більш чіткі порівняно зі стандартними мікроскопами двовимірні та тривимірні зображення. Крім того, на сучасних конфокальних мікроскопах можна проводити вимірювання параметрів згасання флуоресценції.

Ще один тип «революційних» мікроскопів функціонує, начебто, всупереч основним фізичним принципам флуоресценції. Атоми в них збуджуються світлом із довжиною хвилі, більшою, ніж у флуоресценції, а не меншою. Насправді ніякі закони фізики при роботі цих мікроскопів не порушуються, просто при достатній інтенсивності світлового потоку з більшою довжиною хвилі в той самий атом одночасно можуть потрапити два фотони, поглинена електронами енергія подвоюється, і її виявляється достатньо для збудження флуоресценції. Тому такі мікроскопи називаються двофотонними. А оскільки світловий потік максимально сконцентрований у фокусі об'єктива, забезпечується умова високої роздільної здатності зображень. Двофотонні мікроскопи відрізняє також здатність реєструвати флуоресценцію у зразках на глибині до 1,5 мм і можливість суттєво зменшити несприятливу дію збуджуючого випромінювання як на об'єкти, що досліджуються, так і на флуоресцентні репортери.

Кількісну інформацію із цифрових зображень витягують за допомогою комп'ютерних програм аналізу зображень. Вимірюють інтенсивність флуоресценції та її просторовий розподіл, оцінюють спектральні характеристики випромінювання, визначають кількість флуоресціюючих частинок, наприклад клітин, характеризують тимчасові та поляризаційні параметри флуоресценції. Спеціальні аналітичні прийоми (так звана флуоресцентна кореляційна спектроскопія) дозволяють використовувати конфокальну та двофотонну мікроскопію для дослідження руху навіть одиничних флуоресціюючих молекул!

Що висвітлили у мікросвіті флуоресцентні репортери

Флуоресцентні репортери довго і успішно служать у багатьох, якщо не в усіх сферах експериментальної біології. Однак є такі галузі, де вони відіграли ключову роль.

З використанням флуоресцентних репортерів було експериментально доведено модель рідкокристалічної структури всіх біологічних мембран. Згідно з цією моделлю, при всій її структурній цілісності мембрана досить «рідка», щоб окремі її компоненти могли переміщатися у потрібні сторони. Таке уявлення дозволяє зрозуміти основні молекулярні механізми функціонування мембран, і навіть властивості живих клітин у цілому.

Значною мірою завдяки інформації від флуоресцентних репортерів прояснилися механізми трансформації енергії у клітинах. Особливу роль тут відіграли флуорофори, що дозволяють реєструвати внутрішньоклітинний та внутрішньомітохондріальний рН, а також різницю електричних потенціалів на мембранах. З їх допомогою насамперед було виявлено механізм поєднання енергодонорних реакцій окислення з енерговитратним синтезом аденозинтрифосфату (АТФ) – універсального постачальника енергії для більшості метаболічних процесів. Крім того, була вивчена природа накопичення різних речовин у цитоплазмі та в клітинних органелах за рахунок мембранного електричного потенціалу та градієнта рН.

Життєдіяльність клітин забезпечується сукупністю скоординованих у просторі та часі біохімічних реакцій, а за координацію відповідають так звані сигнальні системи. Основні компоненти цих систем були ізольовані та охарактеризовані за допомогою методів традиційної біохімії та молекулярної біології. Однак тільки підходи, засновані на застосуванні флуоресцентних репортерів, показали безпосередньо, де пролягають ці шляхи і як по них проходять сигнали, - стало можливим у реальному часі стежити за взаємодією сигнальних білків або оцінювати динаміку експресії генів окремо взятій клітині. За допомогою флуоресцентних репортерів вдалося виявити і невідомі раніше сигнальні компоненти, наприклад, виявити роль іонів Са +2 як сигнального посередника в багатьох регуляторних реакціях.

У другій половині ХХ століття у мікробіології виникла проблема, яку назвали «великою аномалією обліку мікроорганізмів за допомогою чашок Петрі». «Винниками» виявилися флуоресцентні репортери, два барвники нуклеїнових кислот – акридиновий помаранчевий та 4,6-діамідіно-2-феніліндол. Оцінити вміст мікроорганізмів у природному зразку можна або підраховуючи колонії, що виросли на чашці Петрі (при достатньому розведенні «посівного матеріалу» кожну колонію утворюють нащадки лише однієї клітини), або безпосередньо підраховуючи під мікроскопом самі мікроорганізми, фарбовані флуоресцентними барвниками нуклеїнових. Так от, флуоресцентні репортери завжди виявляли значно більше мікроорганізмів, ніж аналіз із чашками Петрі.

Для пояснення цієї суперечності було висунуто дві гіпотези. Згідно з першою, частина клітин, які перебувають у стані спокою, не розмножується на чашках Петрі. Згідно з другою, умови культивування (склад середовища, температура та ін) не відповідають потребам деякої частини популяції. Перевірка цих гіпотез показала, що можливе і те, й інше. Більше того, було дано поштовх до формування двох нових великих напрямів досліджень. Перше пов'язане з вивченням так званого життєздатного, але не культивується стану мікроорганізмів. Зрозуміла практична значущість таких досліджень: наприклад, патогени людини у цьому стані можуть бути невидимі для стандартних методів діагностики та стійкіші до лікарських препаратів. Другий напрямок - виявлення та вивчення мікроорганізмів у природних зразках шляхом прямого аналізу їх нуклеїнових кислот, без попереднього отримання чистих культур, як це робилося раніше. Цей напрямок отримав власну назву - метагеноміка. Завдяки методам метагеноміки (до речі, деякі з цих методів припускають використання флуоресцентних репортерів) з'явилася можливість по-новому побачити біологічну різноманітність мікроорганізмів в окремих екосистемах та на Землі загалом.

Отже, сучасні флуоресцентні репортери - це величезна армія фахівців, і багато хто з них уже має гучну славу в експериментальній біології. Їхні репортажі дозволили краще розглянути ті куточки мікросвіту, куди може заглянути світло. Однак багато дослідників, що працюють у цій галузі, вважають, що все, побачене нами у світлі флуоресценції досі, – це лише початок!

поглинання світла. Закон Бугера Ламберта, бера

Поглинання світла - явище зменшення інтенсивності світла під час проходження його через речовину. Зменшення інтенсивності світла відбувається в результаті того, що енергія світла переходить в інші види енергії: енергію активізації, іонізації молекул, енергію теплового хаотичного руху частинок у речовині та ін. умови, що розчинник не поглинає цю довжину хвилі, інтенсивність світла також зменшується за експоненційним законом. Закон поглинання світла для пофарбованих розчинів називають законом Бугера-Ламберта-Бера: I = Io * e - чcd, де С - концентрація розчину; ч - показник поглинання для розчину одиничної концентрації, залежить від природи розчиненої речовини та довжини хвилі падаючого світла.

Спектральні властивості та характеристики хромофорів. Діаграма Яблонської

Хромофор – молекула, здатна поглинати світло певного діапазону довжин хвиль.

Так, карбонільна група є хромофором, що поглинає в області 280 нм, в той же час кетони - безбарвні речовини.

Первинними стадіями фотобіофізичного процесу є поглинання світла хромофорною групою та утворення електронно-збуджених станів (ЕВС). При поглинанні світла молекули, іони, атоми, радикали та інші типи частинок, що беруть участь у хімічних перетвореннях, можуть переходити до електронно-збуджених станів. Вони відбувається зміна фізичних і хімічних властивостей молекул проти основним станом. Змінюються дипольний момент, геометрія, розподіл електронної щільності, кислотно-основні властивості і т. д., і молекули в збудженому стані мають іншу реакційну здатність, що проявляється не стільки в зміні швидкості реакції, скільки в їх іншому, в порівнянні з основним станом, напрямі. Поглинання та випромінювання світла добре ілюструє діаграма рівнів енергії, запропонована Яблонським

В основному стані всі електрони займають найнижчі електронні рівні і розташовані на орбіталях попарно, причому їхні спини мають протилежний напрямок (антипаралельний). Такий стан молекули називають синглетним незбудженим (основним) станом та позначають як S0. Також позначають енергетичний рівень незбудженої молекули

При поглинанні світла відбувається перехід одного з електронів на орбіталь, що вище лежить, але його спин не змінюється. Такий стан молекули та її енергетичний рівень позначають як S1 чи S2 залежно від цього, який рівень перейшов електрон. Цей синглетний збуджений стан позначають як S*. Основний, перший і другий електронні стани позначають S0, S1, і S2 відповідно. Кожен із цих рівнів енергії може складатися з безлічі коливальних енергетичних рівнів, що позначаються 0, 1, 2 і т. д. Вплив розчинника в даній схемі не береться до уваги. Переходи між різними електронними рівнями позначені вертикальними лініями. Така вистава використовується, щоб наочно показати миттєву природу поглинання світла. Цей процес відбувається приблизно за 10-15 с - час, надто короткий для помітного зміщення ядер.

Класифікація електронних переходів

Діаграма Яблонської

Фізичні процеси, які у електронно-збудженому стані молекул, прийнято представляти як діаграми Яблонського. Основними безвипромінювальними процесами дезактивації нижнього збудженого стану S 1є внутрішня конверсія (перехід між станами однакової мультиплетності) та інтеркомбінаційна конверсія (перехід між станами різної мультиплетності, наприклад, синглет-триплетний перехід S 1 ®T 1). Внутрішня конверсія S 1® S 0- Порівняно повільний процес. Тому у збудженому стані S 1можуть спостерігатися процеси спонтанного випромінювання фотона (спонтанне випромінювання) та фотохімічні реакції. Випромінювальними процесами є дозволена по спину флуоресценція та заборонена по спину фосфоресценція.

Електронні спектри поглинання в УФ та видимому діапазонах, дають важливу інформацію про структуру та властивості електронно-збуджених станів молекул. Знання спектра поглинання речовини є обов'язковою умовою фотолюмінесцентних та фотохімічних досліджень. Коротко зупинимося на класифікації електронних переходів

Електрони в органічній молекулі розташовуються на молекулярних s-, p- та n-орбіталях. На кожній молекулярній орбіталі містяться два електрони, що відрізняються спинами. При збудженні молекули світлом відбувається перехід електрона із зайнятої зв'язувальної орбіталі на вільну орбіталь, що розпушує. Такі переходи позначають відповідно до їх орбітальної природи: s-s*, n-s*, p-p* та n-p *.

Смуги поглинання, зумовлені переходами s®s*, знаходяться переважно у вакуумній УФ області< 200 нм, где обычные спектрофотометры не применимы.

Переходам n-s *відповідають смуги поглинання УФ області. Наприклад, органічні сполуки, що містять n-Електрони, локалізовані на орбіталях гетероатомів, О, N, S, поглинають УФ світло в області близько 200 нм.

Переходам p®p*і n®p*відповідають смуги поглинання у середній УФ-області. При поєднанні кратних зв'язків смуги, обумовлені цими переходами, зміщуються в ближню УФ і видиму область спектра. Переходи n®p* характерні сполук, що містять такі хромофорні групи, як С=О, C=S, N=N; ці переходи часто виявляються забороненими, і відповідні смуги поглинання мають порівняно низьку інтенсивність.

Ця класифікація придатна переважно щодо простих молекул. У складних молекулах певний внесок у електронний перехід можуть робити електрони, що знаходяться на орбіталях різного типу.

Значний інтерес становлять електронні переходи із перенесенням заряду.Якщо в молекулі є електронодонорна та акцепторна групи, і вони знаходяться в p-електронному сполученні, то перехід S 0 S1 може супроводжуватися переносом заряду від донора до акцептора по ланцюгу сполучення, як наприклад, в даному стириловому барвнику:

У цьому випадку говорять про електронний перехід з внутрішнім перенесенням заряду. Відповідні смуги поглинання зазвичай характеризуються високою інтенсивністю та розташовуються у видимій, а іноді й у ближній ІЧ області.

Для слабозв'язаних органічних донорно-акцепторних комплексів можуть спостерігатися смуги поглинання, що належать до електронного переходу з перенесенням заряду від донора до акцептора через простір ( міжмолекулярне перенесення заряду). Такі комплекси часто називають комплексами із перенесенням заряду. Довгохвильові смуги поглинання таких комплексів мають порівняно низьку інтенсивність і можуть перебувати в ближній УФ, видимій та ближній ІЧ області спектра.

У металорганічної хімії розрізняють смуги поглинання, відповідні перенесення заряду від ліганду до металу ( ПЗЛМ) та від металу до ліганду ( ПЗМЛ).